Cytométrie en flux CMF
What is Flow Cytometry? • Cytometry mesure des paramètres physiques et chimiques d’une cellule ou autre particule biologique
• Flow Cytometry mesure des paramètres d’une cellule dans un flux. 1968, Wolfgang Gohde from the University of Munster (Patent No. DE1815352) named ‘pulse cytophotometry” 1978, the name was changed to ‘flow cytometry’
• Flow Sorting (Flow Cytometric Cell Sorting) flow cytometry + isolement et collecte des cellules selon des caractéristiques bien définies Adapted from ppt by Dr. EDWARD F. SROU
A cytometer consists of:
Electronics
Fluidics
Light detectors FL3 PerCP, Cy5
FL2 PE
FL1 FITC SSC
Laser Light 488nm
FSC
Computer
Concepts propriétés optiques intrinsèques des particules: taille, forme, granulosité Fluorescence: interne ou externe Temps: utile pour la cinétique Comptage: nombre de cellules
Properties intrinsèque de la cellule : Granularity or Internal Complexity
•Side Scatter (SSC): Granulosité
LASER
•Forward Scatter (FSC) : taille : size Granulocyte
Granulosité Monocyte Lymphocyte
Taille
Fluorescence
LASER
Emitted Fluorescence Intensity ∝ Binding Sites
Fluorescence (suite) 1 seul parametre peut etre présenté sur 1 histograme
Number of Event
FITC
FITC
FITC FITC
FITC
FITC FITC FITC FITC
FITC
Fluorescent Intensity
2 parametre peuvent etre présentés sur un cytograme à deux dimension
1
2
3
4
Cellules en suspension
Cellules en nappe
Trypsination pour décoller les cellules lavage
Fixation et perméabilisation Incubation & lavage
+ Solution de bloquage
Protocol CMF
Incubation & lavage
+ Ac fluorescent Incubation & lavage
+ TP et lecture par le CMF
Détermination des différents paramètres (taille, granulosité, fluorescences)
Flow Cytometer Beckman Coulter Epics Altra
BD FACS Calibur
2 laser 4 colors BD FACS Canto II
> 2 laser > 6-7 colors BD LSRII and LSRII Green 4 laser LSRII; 488, 633, 405, 355 LSRII Green; 405, 488, 532, 635 12 colors *DPSS (diode-pumped solid state) 532 nm
Ces signaux séparés par des filtres optiques sont collectés par des photo-multiplicateurs (PMT) → amplifiés → numérisés → traités → stockés par un ordinateur
→ l’ordinateur calcule les données statistiques associées aux distributions des paramètres mesurés et les représente sous la forme:
d’histogrammes (un paramètre)
de cytogrammes (deux paramètres)
Gran anulosité
Granulocyte
Monocyte Lymphocyte
Taille cytogramme
histogrammes
cytogrammes
Analyzed Data
•BUT: Caractérisation individuelle, (cellule par cellule) quantitative et qualitative de particules en suspension dans un liquide: * la présence ou l'absence d'un marqueur * suivre une population de cellules par la taille et la granulosité du cytoplasme * évaluer la présence de protéines cytosoliques sur des cellules perméabilisées * suivre un gène rapporteur fluorescent après transfection * évaluer la viabilité d'une population de cellule, sa mortalité et le type de mort (apoptose ou nécrose). * une cellule est-elle activée ? est-elle mourante ? est-elle prête à se diviser ? =˃ distinguer facilement des populations, parfois indifférenciables, à l'œil du microscope
Principales applications Hématologie: une des premières disciplines médicales à bénéficier des applications cliniques de la CMF : mise en évidence du caractère pathologique des cellules analysées. Cancérologie: détection de la cellule pathologique: essentiellement par la mesure d’un contenu anormal d’ADN dans le noyau de la cellule tumorale. Immunologie: détection ou l'identification des sous-types des cellules impliquées dans l'immunité. Cycle cellulaire: suivre la distribution des cellules dans les différentes phases du cycle en fonction de divers stimulus ou de l’ajout de certaines drogues. Pharmacologie: mise au point ou étude de drogues antimitotiques, immunothérapie. Tri des chromosomes (création de banques) physiologie végétale (ploïdie, contenu en ADN, pour la sélection des plantes les plus résistantes), etc. Tri des spermatozoïdes pour la sélection du sexe de l’embryon
•Avantages: • Contrairement à la microscopie optique à fluorescence, la cytométrie permet d'analyser un très grand nombre de cellules • Contrairement aux techniques de biologie moléculaire, qui permettent de travailler sur un ensemble de cellules, la cytométrie permet d'établir des paramètres cellule par cellule. •
On peut faire des doubles ou des triples marquages.
•
Peut s’effectuer à la vitesse de plusieurs milliers d’événements par seconde
* Inconvénients: Ne fonction pas sur les tissus.
FACS (fluorescence activated cell sorting)
FACS Les cellules passent 1 par 1 dans un flux et elles sont analysé par un laser + Ac marqués avec des fluorochromes
Cellules marquées en vert (ex FITC)
Cellules non marquées
Cellules marquées en rouge (ex TRITC)
Human bone marrow suspensions + T10B9 Monoclonal Antibody → + rabbit complement => Specific elimination of αβ+cells cells bearing αβ+ T cell receptor (blue arrow in the upper pane) =˃ reduces risks of graft-versus-host disease (GVHD) after allogeneic stem cell transplantation => The remaining ϒδ+ T cells (lower panel) presumably contribute to selective killing of host leukemia cells.
Luminex Assays ou xMAP (multi-analytes profiling)
Principe Utilise: 1- Des microbilles (en polystyrène, 100 ≠ types) couplées à des Ac 2- Des Ac liés à un fluorochrome (PE) 3- CMF à 2 lasers
Principle
Y
WASH Y
READ ON FLOW CYTOMETER
Y Y
Y
Y Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y
Y Y
BEADS
LYSATE, SERUM OR SUPERNATANT
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y
Y
IFN
Y
Y
TNF
Y
Y
Y
Y Y
Y Y
PE-Ac
Y
Y Y
Y
IL-10
Y
Y Y
Y Y
Y
Y
Y Y
Y
IL-5
Y
Y Y
Y Y
Y
IL-4
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
Y
Y
IL-2
Y
Y
Microbilles (microsphères) • Lors de leur fabrication, 2 fluorochromes sont incorporés à l’intérieur des billes avec un % précis => 100 ≠ types
5.6µm & 6.5µm Microspheres Polystyrene & Magnetic
Red & Infared fluorophores
X MAP Detection System
Microbilles (microsphères) • les billes sont excitées par le laser rouge => Chaque bille reémet 1 fluorescence rouge d’1 façon différente et sera identifiée par les intensités des 2 fluorescences rouge et infra-rouge enregistrées par un capteur à la sortie du flux. => Chaque bille a ainsi son propre code couleur d’identification
2-Laser Flow Cytometer
Red laser - bead classifier Green laser - reporter quantifier
Microbilles (microsphères) Servent de support solide à différentes molécules se liant de façon covalente:
Antigènes purifiés Anticorps de capture
Ag
Sondes nucléiques caractéristiques d’allèles particuliers
Sonde
Principle
Y
WASH Y
READ ON FLOW CYTOMETER
Y Y
Y
Y Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y
Y Y
BEADS
LYSATE, SERUM OR SUPERNATANT
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y
Y
IFN
Y
Y
TNF
Y
Y
Y
Y Y
Y Y
PE-Ac
Y
Y Y
Y
IL-10
Y
Y Y
Y Y
Y
Y
Y Y
Y
IL-5
Y
Y Y
Y Y
Y
IL-4
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
Y
Y
IL-2
Y
Y
Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y Y
Y PE
Red laser - quantifie les billes 2-Laser Flow Cytometer
Green laser - quantifie la fluoresence PE
Détection d’anticorps
Détection d’antigène Laser rouge
Conjugué Anti-Ag couplé à PE
Ag à détecter
Détection d’allèles spécifiques
Streptavidine
Obtention des Amplicon biotinylé
PCR (ou RT-PCR) de l’ADN ou ARN cibe avec des amorces spécifiques biotinylées. ⇒Les produits de PCR biotinylés obtenus sont ensuite dénaturés = amplicons biotinylés
ELISA versus CBA Assays ELISA
Luminex
Types of analytes
antibodies, cytokines
Antibodies, cytokines
Number of simultaneous analytes Type of readout
One
Up to seven or more Flow cytometry
Colorimetric
